SR9087 - Développement de microréseaux d'ADN pour la détection des principaux contaminants microbiens dans les échantillons d'eau

Le ministère a financé ce projet dans le cadre du Programme de nouvelles orientation de recherche de 2001.

Chercheur principal

D^r Shu Chen, division des services de laboratoire, Université de Guelph (la note du rédacteur en chef 2011: les coordonnées du chercheur ne sont pas disponibles) (site Web en anglais seulement)

Objectifs

1. Concevoir et préparer des sondes d’ADN de pathogènes supplémentaires appropriés pour la mise en jeu ordonné.

2. Mettre en place et optimiser les essais de PCR multiplex pour la préparation d’une cible fluorescente d’ADN appropriée pour l’hybridation.

3. Évaluer le rendement des essais de PCR/puce utilisant des pathogènes cibles contrôlés et des échantillons d'eau instantanés.

Avantages escomptés

1. L’achèvement de ce projet, s’il porte ses fruits, mènera à la réalisation d’une puce d’ADN pratique, qui servira à la détection simultanée des principaux pathogènes d’origine hydrique et alimentaire dans un seul échantillon.

2. Ce projet profitera aux industries impliquées dans la biotechnologie agricole ou environnementale car la technologie qu’il fournira permettra aux chercheurs en milieu universitaire ou industriel de faire des analyses génétiques à grande échelle, rapidement et de manière avantageuse sur le plan économique.  

Résultats

Les principaux contaminants présents dans les sources d'eau de surface et souterraine (Cryptosporidium, Giardia, Cyclospora, Escherichia coli, Salmonella, Listeria et Campylobacter) sont des causes fréquentes de maladies d'origine hydrique. Pour assurer l'innocuité de l'eau et la qualité de l'environnement, il est essentiel de disposer d'une méthode de détection rapide, simple et économique de ces mêmes contaminants pathogènes. L’objectif de cette recherche est de mettre en œuvre un test fondé sur une puce pour détecter ces contaminants dans les échantillons d’eau.

Ce projet fait suite à une autre recherche en cours sur le développement d'un test par microréseau d'ADN pour la détection des principaux pathogènes bactériens d'origine alimentaire (Escherichia coli producteur de toxine Shiga, E. coli sérotype O157 :H7, Campylobacter, Salmonella, Salmonella typhimurium DT104 et Listeria monocytogenes). Dans ce projet, nous avons élargi le nombre de pathogènes couverts par le microréseau pour y inclure les principaux parasites transmis par l'eau, à savoir Cryptosporidium parvum, Giardia intestinalis et Cyclospora cayetanensis. La fonctionnalité du microréseau élargi et des procédures connexes de détection des neuf pathogènes a été démontrée sur des cultures pures et des échantillons d'eau instantanés.

Le microréseau élargi (8x9 réseaux en quadruplets) était constitué de 14 sondes pour la détection des parasites et de 47 sondes pour la détection des bactéries. Les 14 sondes pour les parasites, mises en place à partir de 39 sondes, contenaient les séquences d’ADN du mur d’ookyste encodant la protéine (cpr1) du gène de C. parvum, du gène ß-giardin (giar) de G. intestinalis et de la région espaceur interne transcrite (its1) de C. cayetanensis.

Nous avons également mis au point un essai de PCR multiplex fluorescente permettant d'amplifier simultanément les gènes spécifiques à ces trois parasites (cpr1, giar et its1). Les conditions de PCR multiplex ont été optimisées.  L’essai de PCR multiplex pour les parasites a été utilisé conjointement avec l’essai de PCR multiplex pour les bactéries qui avait été mis en place au cours d’un projet distinct dans nos laboratoires afin d’amplifier tous les gènes cibles inclus dans le système.

Le système de microréseau étendu à PCR multiplex a été évalué en fonction de sa spécificité à partir de 30 souches de parasites, 60 souches de bactéries cibles et 52 souches de parasites et de bactéries non cibles. Toutes les souches cibles confirmées ont été correctement détectées; toutes les souches non cibles n’ont pas été détectées. Le système a été également évalué par rapport à sa limite de détection à partir de cultures purifiées et d’échantillons d'eau instantanés. Le système a été en mesure de détecter entre 50 et 100 copies du modèle d’AND en cultures pures et environ 100 copies du modèle d’ADN dans des échantillons des sédiments d'eau instantanés. Le système a été davantage évalué à partir de 30 échantillons de sédiments d'eau instantanés concentrés et de 1 000 litres d’eau de différentes sources. Les échantillons ont été répartis en 21 combinaisons uniques de pathogènes cibles regroupant un, deux, trois ou quatre pathogènes dans un échantillon. Le système de microréseau étendu à PCR multiplex a produit 21 images uniques d’hybridation correspondant correctement à 21 combinaisons uniques.

On en a conclu que le système de microréseau étendu à PCR multiplex mis au point dans le cadre de ce projet permettait de détecter les trois parasites et les six bactéries pathogènes en un seul essai. Il pourrait donc devenir un outil précieux et rentable pour les tests complets d'innocuité de l'eau ou des aliments. Avant de mettre ce système en œuvre dans les laboratoires de diagnostic, on suggère d'améliorer la limite de détection de l'essai et de procéder à d'autres études de validation sur des échantillons d'eau contaminée naturellement.

Informations complémentaires

• Autres projets financés par le Programme de nouvelles orientations de recherche 2001